Riboflavin không có tác dụng rõ ràng khi uống hoặc tiêm. Riboflavin được biến đổi thành 2 co - enzym là flavin mononucleotid (FMN) và flavin adenin dinucleotid (FAD), là các dạng co - enzym hoạt động cần cho sự hô hấp của mô. Riboflavin cũng cần cho sự hoạt hóa pyridoxin, sự chuyển tryptophan thành niacin, và liên quan đến sự toàn vẹn của hồng cầu.
Riboflavin ở dạng flavin nucleotid cần cho hệ thống vận chuyển điện tử và khi thiếu riboflavin, sẽ sần rám da, chốc mép, khô nứt môi, viêm lưỡi và viêm miệng. Có thể có những triệu chứng về mắt như ngứa và rát bỏng, sợ ánh sáng và rối loạn phân bố mạch ở giác mạc. Một số triệu chứng này thực ra là biểu hiện của thiếu các vitamin khác, như pyridoxin hoặc acid nicotinic do các vitamin này không thực hiện được đúng chức năng của chúng khi thiếu riboflavin. Thiếu riboflavin có thể xảy ra cùng với thiếu các vitamin B, ví dụ như ở bệnh pellagra.
Thiếu riboflavin có thể phát hiện bằng cách đo gluthathion reductase và đo hoạt tính của enzym này khi thêm FAD trên in vitro. Thiếu riboflavin có thể xảy ra khi chế độ dinh dưỡng không đủ, hoặc bị kém hấp thu, nhưng không xảy ở những người khoẻ ăn uống hợp lý.
Thiếu riboflavin thường gặp nhất ở người nghiện rượu, người bệnh gan, ung thư, stress, nhiễm khuẩn, ốm lâu ngày, sốt, ỉa chảy, bỏng, chấn thương nặng, cắt bỏ dạ dày, trẻ em có lượng bilirubin huyết cao và người sử dụng một số thuốc gây thiếu hụt riboflavin.
Riboflavin được hấp thu chủ yếu ở tá tràng. Các chất chuyển hóa của riboflavin được phân bố khắp các mô trong cơ thể và vào sữa. Một lượng nhỏ được dự trữ ở gan, lách, thận và tim.
Nhu cầu về riboflavin liên quan đến năng lượng được đưa vào cơ thể, nhưng nó liên quan chặt chẽ hơn với yêu cầu chuyển hóa khi nghỉ ngơi. Bình thường khoảng 0,6 mg/1000 kcal, như vậy thì cần 1,6 mg riboflavin trong một ngày đối với nam và 1,2 mg trong một ngày đối với nữ. Với người cao tuổi thì không ít hơn 1,2 mg trong một ngày, thậm chí cả khi lượng calo đưa vào ít hơn 2000 kcal.
Sau khi uống hoặc tiêm bắp, khoảng 60% FAD và FMN gắn vào protein huyết tương. Riboflavin là một vitamin tan trong nước, đào thải qua thận. Lượng đưa vào vượt quá sự cần thiết của cơ thể sẽ thải dưới dạng không đổi trong nước tiểu. Riboflavin còn thải theo phân. Ở người thẩm phân màng bụng và lọc máu nhân tạo, riboflavin cũng được đào thải, nhưng chậm hơn ở người có chức năng thận bình thường. Riboflavin có đi qua nhau thai và đào thải theo sữa.